本文整理总结了核酸检测实验室污染原因、防污措施★◆◆■、污染的监测及解决方案等问题
答：因为新冠试剂检测的是人内源性内标■★◆，环境样本一般不含有人源细胞，所以检测不出内标■◆◆■■★；偶尔检出内标，可能该环境样本上有人源性细胞粘附，故而检出内标。
2■■★★、N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因吗，灵敏度哪个更高■◆？是否会和其他冠状病毒片段重叠？
各工作区要有一定的隔离◆◆★■★■，操作器材专用，要有一定的方向性。如：试剂准备→标准制备→PCR扩增区及分析区■◆■。
6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；
⑤以前扩增产物的残留污染,这也是 PCR 实验室最容易产生的将造成假阳性的“污染★◆◆”。
进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现■■★■◆。
答：N基因跟1ab都是特异的■■◆■★，不会跟其他呼吸道病原体交叉反应。设计时候■◆★，两个基因的序列不一样■★，导致灵敏度不一样★★■，N基因的灵敏度比1ab灵敏度高。
尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因■■，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真★◆★◆★◆，在样品的收集★★◆、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
●在加入模板时■■◆★■，按照★■★■■“阴性对照-待测样品-阳性对照◆■◆”的加样顺序，操作上应遵循“开管盖-加模板-盖管盖”的原则。
保持实验室空间密闭，避免污染物扩散。立即使用润湿有0■★◆★■.55%含氯消毒剂的毛巾覆盖污染区。必要时（如大量溢撒时）可用过氧乙酸加热熏蒸实验室，剂量为2g/m³，熏蒸过夜★◆■◆★◆；或20g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾，用量8ml/m³，作用1-2小时；必要时或用高锰酸钾-甲醛熏蒸■★◆■◆◆：高锰酸钾8g/m³■■★◆，放入耐热耐腐蚀容器（陶罐或玻璃容器），后加入甲醛（40%）10ml/m³，熏蒸4小时以上。熏蒸时室内湿度60%-80%。
2、阴性对照★★★■：每次PCR实验务必做阴性对照■★★■◆。它包括①标本对照★■◆■◆◆：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照★◆。②试剂对照◆★：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增■■★★，以监测试剂是否污染。
PCR扩增所需要的试剂均应在生物安全柜、装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA■★■：
答：如果新冠样本内标不出，该样本必须复查，可重新混匀该样本提取核酸★★◆■■★，如果重新提取该样本内标还是不出■◆，在排除提取问题的情况下，说明采样不合格◆■，要通知临床重新采样复查■★◆■★■。
严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等■◆■◆■，防止次生危害★★。
实验室一旦发生污染，检测工作应立即停止，直到确认消除污染后才能重新开始检测★■■◆。首先，要查找污染源和明确污染范围。然后，根据污染源和污染范围采取有效的去污染措施，结合各种不同方法以达到最佳效果。
4★■◆. 操作多份样品时，制备反应混合液■★，先将dNTP★◆、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施■★★■，防止和消除污染★★◆★。
1★■★■■、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志◆◆★。阳性 对照要选择扩增度中等★■■◆、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)★◆。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大◆★◆★■■.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定★◆★，检验人员心中有数时◆◆，在以后的实验中可免设阳性对照★◆■■。
答：因为试剂采用的是内源性内标，内源性内标是用人源基因标记，此基因存在于人的表皮细胞内，操作过程中就可能会出现人源性的污染◆★◆■★◆，另外环境污染也有可能导致内标增长，这也是前面提到的建议做环境样本质控。
近期随着德尔塔毒株疫情的再起，高强度的核酸检测任务已然成为了我们检验人的工作常态，核酸检测实验室污染问题也是大家近期比较关心的话题■◆■★◆。
本文整理总结了核酸检测实验室污染原因、防污措施、污染的监测及解决方案等问题■◆■◆◆。
试剂准备区、样本准备区、扩增区、检测区等必须备有其各自必需的仪器设备、工作服、手套■★■■◆、加样器和通风系统★◆■。在每个区使用的试剂和废物,必须直接在其各自的区域内分装或包装。操作人员必须注意防止通过他们的头发、眼镜◆◆、首饰和衣服将扩增产物从污染区携带至清洁区的可能性■■★■。
实验台面可使用10%的次氯酸钠(漂白剂)清洗,然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸钠。次氯酸钠具有氧化损伤核酸的作用,从而使可能的留在实验台面的扩增产物被破坏掉。要注意的是,次氯酸钠不能区分提取的目的 DNA 和 PCR 扩增产物,用次氯酸钠处理的样本不能用于核酸扩增检测■★。在实际工作中,有些物品比如放置扩增反应管的盘必须从污染区转回到清洁区时◆■■★◆★,在转回之前,应将其置于2%~10%的次氯酸钠溶液中过夜,并充分冲洗。
3．引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因★◆■◆★。
3■◆■★■. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上■■◆★■，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
立即用吸水纸覆盖，并使用0.55%含氯消毒剂进行喷洒消毒。消毒液需要现用现配，24小时内使用。
答：如果是个别单一通道翘尾，不管是FAM还是VIC通道，首先按照要求复查，复查建议重新采样★■，如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证，如果复查阴性判读阴性■◆★★★，如果复查还是同一通道翘尾★◆◆，就要对结果仔细审核，一是要排除实验室污染，二是要对病人信息了解清楚，从临床症状及接触史排查，如果没法确认■■■，建议必须重新采样复查，如有必要可以采用另一家试剂来验证。如果出现大量的弱阳性扩增翘尾，首要原因是考虑实验室污染★◆★■■■，可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。
如对以前扩增产物进行适当修饰,应可以消除其污染后面新的扩增检测,但为保证不影响靶核酸的扩增检测,扩增产物修饰方法必须遵循两个基本原则:
6、采集环境样本检测新冠状病毒，为啥大部分样本内标不出◆■■◆，偶尔个别样本检测出内标■★★◆★★？
答■◆■：新冠病毒由于是RNA病毒■★◆◆◆◆，容易降解，另外检测结果也和取样，核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关，需要逐一分析，同时可以结合临床症状判读◆★◆■■。
●面对多份样品，制备反应混合液时■■★★◆，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好◆■■★，然后用分液功能进行分装。
PCR扩增可以引起实验室中扩增产物的累积,通常一次典型的PCR 扩增可以产生109拷贝的靶序列,如果气溶胶化,甚至最小的气溶胶都会含有106拷贝的扩增产物。如果不加以控制,在短期内累积的气溶胶化的扩增产物即会污染实验室中的试剂◆■■◆◆、仪器设备和通风系统,从而造成严重的实验室“污染”,出现大量的假阳性结果。
目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管◆◆■★★，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：
2. 使用一次性吸头■★，严禁与PCR产物分析室的吸头混用★★◆★■，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染◆★◆；
7◆★★★■■. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区◆■◆■；
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